实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳

[实验原理]
DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样， 迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA， 即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1．恒温培养箱
2．琼脂糖凝胶电泳系统
3．小型高速离心机
4．高压灭菌锅
5．紫外核酸检测仪
(二)材料
1．pQE-31和pUC18-CAT质粒
(三)试剂
1．50xTAE(50倍体积的TAE贮存液)
配1000mL 50xTAE：
Tris 242 g
冰醋酸 57 mL
0.5mol／L EDTA 200 mL
pH 8.0
2．凝胶加样缓冲液(6x)
溴酚蓝 0.25％
蔗糖 40％
3．琼脂糖
4．溴化乙锭溶液(EB) 0.5μg／mL
5．250bp DNA 分子量标准

[实验步骤]
(一)制备琼脂糖凝胶
根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度％ 线性DNA的有效分离范围／kb
0.3 5-60
0.6 1-20
O.7 0.8-10
O.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-4
2.0 0.1-3

实验用1.2％琼脂糖。称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。
(二)胶板的制备
1．取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。
2．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。
3．将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
4．待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。
5．加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。
(三)加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。
(四)电泳
1．接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V／cm。
2．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。
(五)染色
将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE缓冲液中加两滴2mg/mL的溴化乙锭储存液即可)，在脱色摇床上缓慢摇动下染色20-30分钟。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。

[实验结果]
在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用)。